公元1908年，慈禧太后病倒，据说光绪皇帝听说了慈禧的病讯之后，还曾面露喜色。这件事情很快传到了慈禧的耳朵中，慈禧害怕自己一死，光绪就会掌权报复自己，于是便想办法害死了他。至于，慈禧到底是如何害死光绪的，历来有两种说法。一种是著名的历史学家启功所说，说慈禧用下了毒的酸奶毒死了光绪。据启功先生说，他的曾祖当时为礼部尚书时，作为主管礼仪、祭祀之事的最高官员，在西太后临终前，他要昼夜守候在她下榻的乐寿堂外。西太后得的是痢疾，所以，从病危到弥留的时间拉得比较长。就在宣布西太后临死前，启功先生的曾祖父看见一个太监端着一个盖碗从乐寿堂出来。出于职责，他就问这个太监端的是什么，太监回答说："是老佛爷赏给万岁爷的塌喇。""塌喇"在满语中的酸奶的意思。光绪在中南海的瀛台，之前也从没听说过他有什么急症大病。但送后不久，隆裕皇后的太监小德张就向太医院宣布光绪皇帝驾崩的讯息。随后，这边就传出慈禧太后去世的消息。由此，后人推测，一定是慈禧太后命人在那碗"塌喇"里下了毒，毒死了光绪。此外，据一位名叫屈桂庭的医生说，他过去曾亲自为光绪皇帝治过病。他说在光绪三十四年十月十八日，最后一次进宫为光绪皇帝诊病时，发现光绪皇帝本已逐渐好转的病情却突然恶化，在床上乱滚，大叫肚痛。三天之后，光绪帝就去世了。这就更加证明了光绪有可能使被慈禧太后等人毒死的。
另外，还有一种说法，说不是慈禧，而是李莲英害死了光绪。据《清室外记》记载："皇帝宾天之情形及其得病之由，外人无由详知，惟藏于李莲英辈之心中。关于太后、皇帝同时而崩，北京城中，言人人殊，然欲查其原因，则实毫无线索。但日处忧城之中帝，一旦再操大柄，自为李莲英辈之不利。可以断言，当日颐和园中之事，或为太后所不及知者。据当时目击者论之，此亦情势所可有。"也就是说慈禧太后的亲信太监李莲英等人，平日里狗仗主势，经常中伤和作弄光绪皇帝。他们怕在西太后死后，光绪再操权柄，会不利于他们，所以就先下手为强，在西太后将死之前，先将光绪帝害死。这一说法同时为英国人普兰德所著的《慈禧外传》和德龄的所写的《瀛台泣血记》等书所认同。德龄以亲生的经历认定光绪皇帝就是被李莲英害死的。她的书中写道："李莲英眼看太后的寿命已经不久，自己的靠山，快要发生问题了，便暗自着急起来。他想与其待光绪掌了权和自己算帐，不如让自己先下手的好。经过几度筹思，他的毒计便决定了。"近来奴婢听许多人说，万岁爷的身子很不好"……"奴婢愿意瞧瞧他看，或者可以使他的身体好起来。"……就在李莲英说过这一番话的第二天，光绪便好端端地也害起很厉害的病来。……只有光绪自己心里是明白的，他料定必是给李莲英在饮食里下了毒，存心要谋杀他。"
此外，在溥仪在《我的前半生》一书中，又提出了另一种说法，说是袁世凯毒死了光绪皇帝。袁世凯在戊戌变法时辜负了光绪的信任，在关键时刻出卖了皇上。袁世凯担心一旦慈禧死去，光绪重新掌权，自己将死无葬身之地。于是便借进药的机会，暗中下毒，将光绪毒死。这种说法，在当时宫内太监中间流传很广，溥仪在《我的前半生》一书中，就记载了这一说法：说"光绪皇帝在死的前一天还是好好的，只是因为用了一剂药就坏了，后来才知道这剂药是袁世凯使人送来的。按照常例，皇帝的病，每天太医开的药方都要分抄给内务府大臣们每人一份，如果是重病，还要给每位军机大臣一份。据内务府某大臣的一位后人告诉我，光绪皇帝死前得的不过是一般的感冒，他看过那些药方，脉案极为平常，加之有人前一天还看到他和好人一样站在屋里说话，所以，当人们听到光绪病重的消息时都很惊异，。更奇怪的是，病重消息传出不过两个时辰，就听说已经"晏驾"了。"由此可见，溥仪认为是袁世凯毒死了光绪帝。
上面的这些说法，都认为光绪帝时被人害死的。因为这一疑案是发生在皇宫内廷，外边的人就更难以知晓真实的内幕，所以，数十年来这一疑案始终悬而不决，众说纷纭。
二十世纪三十年代，光绪皇帝的陵墓被军阀炸开，后来，有人对光绪皇帝的遗体进行过研究，却并未发现中毒的成分。由此光绪皇帝的死因变的更加离奇。后来，有人根据宫廷档案的记载，对光绪皇帝的死因进行了研究。最后，竟然惊奇的发现光绪皇帝其实是病死的。他和慈禧太后先后而死，并没有什么内幕消息，只不过是历史的巧合而已。
