近百年来，光绪皇帝的死因有两种说法：一是谋杀说；二是正常死亡说。
长期以来，中国史学界的主流意见倾向光绪帝死于谋杀。人们普遍怀疑慈禧及其帮凶害怕光绪帝在慈禧死后掌握政权，重翻前案，为此痛下杀手。百年间这类猜测不胫而走，广为流传。谋杀的嫌疑人有慈禧太后、袁世凯、李莲英、崔玉贵等。
清朝在皇帝的饮食安全、医疗保健方面有一套极为严格的制度，袁世凯身为大臣，无法接近皇帝，没有下手的机会，他若起意谋杀，只能买通太监下手。李莲英和崔玉贵身为太监，但如果不奉旨意，也难以接近皇帝；更何况李莲英缺乏谋杀的动机，他平素对光绪帝多有关照，光绪帝曾说过"若无李俺答，我活不到今日"这样的话，可见，即使光绪帝上台执政重翻旧案也跟李莲英无关，所以，他作案的可能性不大。
其实，光绪帝若死于谋杀，主谋元凶基本可以断定是慈禧太后，因为按常情推断，若没有她的指使，一般人不仅没有条件，也没有胆量下这种毒手。执行者很可能是崔玉贵等一帮太监，因为在庚子年间崔玉贵就奉旨杀了珍妃，以此类推，他无疑嫌疑最大。但应该强调，谋杀说属于推断，并无过硬的证据做支撑，是一种基于情理和既往事实做出的自圆其说的猜测。
上世纪八十年代初，"谋杀说"被推翻，光绪帝的死因被学者们定论为"正常死亡"。原来，在清宫档案中，光绪帝的脉案保存得相当完整，史学家会同中医专家系统深入地研究了这些脉案，认为符合病情演进的规律，未见特殊异常症状出现，应为心肺功能的慢性衰竭合并急性感染死亡，并无中毒和其他伤害的征象。这一说法较为广泛地被史学界认同。
然而，近年来这一问题的研究又取得了进展，"正常死亡"说似乎被颠覆，"谋杀"说获得了实质性的支持。中央电视台清史纪录片摄制组等四家单位的专家历时数年，运用高科技手段对光绪帝遗骨、头发、下葬的衣物做了检测，发现其中附着有高含量的三氧化二砷(砒霜)，由此认定光绪死于急性砷中毒，应为他杀。2008年初冬，在北京发布了这一研究成果。此时恰逢光绪皇帝逝世一百周年，所以，别有一番特殊的意义。虽然凶手是谁不能通过检测证明，但专家们一致认同慈禧太后的嫌疑最大。
那么，光绪帝的死因就此获得广泛认同了吗？事情也不是这样简单。对光绪帝之死依然有深入研究的必要，尽管史学家对"检测报告"难以置喙，但这一说法与脉案不合。光绪从病重到逝世，每天医生几次前来诊治，脉案中不仅没有呕吐、腹泻之类的砷中毒症状，反而有八九日不解大便的相反记载。
人们固然可以怀疑脉案被伪造或篡改，因为太医院要看慈禧的脸色，并且在戊戌政变后，也曾奉命伪造过光绪帝病重的脉案。但跟凭空捏造不同，此时光绪帝确实病情严重，治疗正在展开，给皇帝看病，责任极大，按宫廷制度规定，往往几位医生和内务府官员、王公大臣同时在场，反复斟酌，集思广益，方才落笔，写好脉案之后，皇帝也可能过目。当时，负责治疗的医生人数不少，轮班诊治，既有中医，也有西医，既有太医院的御医，也有各省举荐的临时效力的医生，想操纵这些人篡改脉案，谈何容易？更何况光绪死后的次日慈禧就病故，四年后清朝亡国，改朝换代之后，这些医生依然在世，留有日记或回忆录，其中若有篡改、伪造脉案的黑幕，很难被继续隐瞒，至少也会透出些蛛丝马迹。
