1852年，太平军先是转战于湖南、湖北两省，继而挥师南下，进入安徽，并攻克了军事重镇安庆。安庆失陷后，安徽巡抚蒋文庆战死殉国。清廷命周天爵为安徽巡抚，驻守颍州，继续指挥军队与太平军作战。
周天爵担任安徽巡抚期间，发生了一件趣事。周天爵知道太平军作战很厉害，不能强攻，便建议进行毒攻，将30万斤断肠草扔到长江及附近的河流里，让饮用长江水的太平军肠穿肚烂而死。
这种办法一点效果都没有，结局可想而知。
1853年，周天爵由于年岁已高，加上身心交瘁，病逝于颍州军营中，时年88岁。晚清时期，人们的平均寿命很低，能够活到70岁以上的人就非常少，周天爵在三起三落的挫折和打击下，还能活到88岁高龄，实属罕见。
周天爵死后，朝廷念及他没有功劳也有苦劳，追赠尚书衔，追加"文忠"的谥号。在清朝，"文忠"谥号相当尊贵，几乎不会将它赐给没有获得翰林的人。周天爵并非翰林出身，还能够得到"文忠"的谥号，主要是朝廷为了嘉奖他"秉性忠直，勇敢有为，心地品行迥超流俗"。
