一年后，陈胜吴广在大泽乡发动起义，六国百姓群起反秦，刘邦回到沛县，带领众人杀掉县令，自称沛公，开始了反秦的峥嵘岁月。因为刘邦为人豪爽，他昔日在沛县的老乡、旧友和部下纷纷前来投奔。周苛、周昌二人也找到刘邦，跟着刘邦打天下。
关于周昌兄弟，有一定争议。有人认为，刘邦在押送囚犯时，周昌兄弟就一直在身边，后来跟随刘邦落草为寇，跟随刘邦一起反秦。也有人认为，周昌兄弟是在刘邦回到沛县之后才跟随刘邦。但不管如何，周昌从此就跟定了刘邦，而且，从未叛变。
最初，刘邦任命周昌为旗手、周苛为宾客。刘邦攻入咸阳，被封为汉王后，周昌被任命为中尉，周苛为御史大夫。公元前203年，荥阳之战中，项羽活捉周苛，周苛宁死不降，最终被项羽烹杀。周苛的死，让刘邦看到了周氏兄弟的忠心，从此，刘邦更加信任周昌，几乎每一次出征，周昌必然贴身跟随刘邦。刘邦登基之后，封周昌为汾阴侯。
汉朝初年，沛县老乡众多，只有周昌和刘邦最为亲厚。周昌可以不经请示直接入宫，也敢于当众骂刘邦，连萧何、曹参对周昌都十分忌惮。一次，周昌入宫，见刘邦大白天正在抱着戚夫人亲热，周昌冷哼一声，转头就走，待到刘邦追赶上来，周昌骂道："陛下即桀纣之主也！"
刘邦听完，虽然哈哈大笑，但从此更加敬畏周昌。
