光绪的病情突然转危，不久死去。名医屈桂庭在《诊治光绪帝秘记》记载光绪死前三天"在床上乱滚"，"向我大叫肚子痛得了不得"，且"面黑，舌焦黄"，"此系与前病绝少关系"。而光绪入殓也一反常规地由宫内太监办理，讳莫如深。
据说是慈禧令太监将他毒死的。有的学者认为，由于袁世凯的叛卖告密，使慈禧镇压了维新运动。袁世凯担心慈禧死后光绪重新执政，将会问罪于他，于是就与庆亲王勾结，打算废黜光绪，立庆亲王之子为帝，事不成，就下手毒杀了光绪。又有学者认为光绪是病死的。政治上的失意，长期的精神抑郁，更使他患有严重的神经官能症，心悸、失眠、食欲不振等症状相继出现，逝世前一年已病入膏肓，直接死亡的原因，可能是心肺功能的慢性衰竭，并发急性感染。这一说法为多数学者接受。
在2008年，经过对光绪皇帝残留的一缕头发的鉴定，证实死于砒霜中毒。
据介绍，载湉坟墓（清西陵的崇陵）曾被打开，后来清理封闭，留下若干头发、遗骨和衣服等由该处妥善保存。由国家清史编纂委员会主任戴逸教授等13位专家联合撰写的《清载湉死因研究工作报告》称，根据相关研究，常人口服砒霜60至200毫克就会中毒身亡。载湉摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。其胃腹部衣物上的砷是其含毒尸体腐败后直接侵蚀遗留所致，而其衣领部位及头发上的大量砷，则由其腐败尸体溢流侵蚀所致。
