1368年正月，朱元璋在应天府（今南京）登基，国号大明，建元洪武，册封36岁的马秀英为皇后。
马秀英成皇后后，富而不奢，贵而不骄，仍保持节俭朴实的生活作风。她严于律己，宽以待人，宫嫔敬服；她留心政事，礼待臣下，关于人民，深得朝野上下敬重。
《马皇后遗传》记载：马皇后病重期间，君臣请祷祀求良医，马皇后自知难以痊愈，坚决不肯。她对朱元璋说："生死有命，祷祀何益？世人良医，亦不能起死回生，倘服药不效，罪及医生，转增妾过。"朱元璋叹息不已，继问马皇后有无遗言，马皇后呜咽道："妾与陛下起布衣，赖陛下神圣，得为国母，志愿已足，尚有何言？妾死后，只愿陛下求贤纲谏，有始有终，愿子孙个个贤能，臣民安居乐业，江山万年不朽。"言毕，51岁的她溘然长逝，宫人恸哭失声，百官一律落泪。
