玛丽却在众多追求者中选择了西班牙王储唐·卡洛斯，他矮小、暴躁、有癫痫，是个货真价实的白痴。但是西班牙王子的身份却足以让玛丽忽视这些缺陷。同样的，西班牙国王腓力二世也觉得与玛丽联姻是一个不错的选择。就在双方即将一拍即合的时候，"拦路虎"出现了：英格兰女王伊丽莎白、法国太后凯瑟琳·德·美第奇为了本国的利益，极力地阻挠这桩婚事。最后，这场婚姻也不了了之。
玛丽的计划落空，在法国受到排挤的她只能重新回到苏格兰，1561年，19岁的女王开始亲政。由于苏格兰的大部分贵族已经改信新教，他们对于女王这位虔诚的天主教信徒十分不满，企图推翻她的统治。年轻的女王没有一点恐惧，她临危不乱地指挥作战，在1562年10月27日的克里奇战役中成功打败了企图推翻她的苏格兰贵族。女王的野心大增，她依旧念念不忘英格兰的王位。
玛丽明白，要想成功继承英格兰的王位，就必须得到伊丽莎白的同意。所以，她不得不在择偶这件事上，充分考虑伊丽莎白的意见，在信上也是直截了当地询问对方"认为哪个求婚者合适。"
但是玛丽的第二段婚姻却是在伊丽莎白的反对下完成的。她的第二任丈夫是达恩利勋爵。玛丽选择他作为丈夫有这样几个理由：第一，达恩利的母亲玛格丽特·道格拉斯是玛丽的祖母第二次婚姻的女儿，因此达恩利的王位继承权仅排在玛丽之后；第二，达恩利是传统的天主教信徒，玛丽认为，与达恩利结婚会增加她继承英格兰王位的可能性。
达恩利勋爵比玛丽小一岁，他热情、容貌俊美、身材高大，两人站在一起十分般配。1565年7月29日，玛丽不顾伊丽莎白和苏格兰各位贵族的反对，与达恩利在霍利鲁德宫的小教堂里举行了婚礼，婚礼过后，达恩利被册封为"苏格兰王国的国王"。
