1368年（洪武元年）正月，朱元璋登基于应天府（今南京），国号大明，建元洪武，册封马氏为皇后。朱元璋对马皇后一直非常尊重和感激，对她的建议也往往能认真听取和采纳。朱元璋几次要寻访她的亲族封官加赏，都被马皇后劝止。对于朱元璋屠戮功臣宿将，马皇后总是婉言规劝，使朱元璋有所节制。
马氏保持节俭朴实的生活作风，册后以后，仍亲自带领公主、嫔妃刺绣和纺织。她自己也是以身作则，平时粗茶淡饭，缝补旧衣。嫔妃皆敬服，都将她比拟为东汉时的明德皇后。马皇后临死之前，朱元璋问她最后的愿望，马皇后说："希望陛下能够求取贤能的人，听取别人的意见，自始至终，认真对待，子孙都能够贤能，大臣百姓都能够有所依靠罢了。
马皇后病逝后，朱元璋非常伤心，从此再也没有立过一个皇后。
