不久，匈奴将军徐庐等五人投降汉朝，汉景帝想封他们为列侯，以鼓励匈奴投降者为汉朝效力，周亚夫再次反对：“这些反骨仔来投降，您却封他们为侯，这不等于鼓励大家都去当汉奸吗？”汉景帝大怒，驳斥周亚夫思想落伍，坚持给徐庐五人封侯。周亚夫特别生气，借口身体不好，愤然辞职。
周亚夫不合作的态度，一再惹恼汉景帝。后来，汉景帝想“考验”一下周亚夫，就请他进宫吃饭，盘子里摆上一大块牛排，故意没给他摆放餐具。周亚夫很不爽了，向服务员喊道：“拿餐具来！”服务员没吭声。周亚夫还要再喊，汉景帝黑着脸说：“咋的，你还不满意？”这明显是皇帝在给周亚夫穿小鞋。周亚夫羞愤不已，很无奈地跪地磕头谢罪。汉景帝刚说一个“起”字，周亚夫马上就站起来，不等汉景帝发话，扭身就走，把汉景帝气得直发抖：“哼！这货真不是个省油的灯，将来我的儿子当了皇帝，恐怕hold不住他。”这时汉景帝就有了除掉周亚夫的念头，这顿饭成了他的夺命索。
也该着周亚夫点背。公元前143年，周亚夫的儿子走后门从国库里私买了一批殉葬用的铠甲，准备将来为老爸陪葬用。他儿子雇佣了一帮民工搬运，却拖欠他们劳务费一直未付。民工们也很强横，追讨无果后直接集体上访，向衙门举报说周亚夫的儿子私买国家禁用品想谋反，周亚夫也被牵连其中。汉景帝知道这件事后，觉得机会来了，汉景帝将周亚夫交给最高法官廷尉审理。
可是不论怎样审讯，周亚夫都不肯承认有罪。一天廷尉亲自审问周亚夫说：“周大人，你想造反么？”周亚夫说：“那些盔甲都是给我出殡用的殉葬品，又不是杀人武器，怎么能说我造反？”廷尉说：“你就算活着在地上不造反，恐怕死了到地下也要造反！”周亚夫听了当即崩溃，正所谓“欲加之罪，何患无辞？”于是他绝食抗议，五天不吃不喝，吐血而死。
司马迁在《史记》中对周亚夫既褒赞且惋惜，说他虽然忠心耿耿，屡立战功，但因为性格过于倔强，对皇帝不够尊重，才导致其悲惨结局。清代诗人查慎行评论说，说周亚夫有“要在地下造反”罪，与秦桧用“莫须有”罪名害死岳飞，有异曲同工之妙。古代帝王专制，君让臣死，臣不得不死！
