在这幅画作中，达·芬奇利用“晕涂法”，将整幅画融合了40层超薄油彩，而每层厚度仅2微米，从中就可以看出达·芬奇的高明之处。而用于作画的油彩，则是有些微不同的颜料组成的，用以营造出蒙娜丽莎嘴角那模糊和阴影的效果。让人隐约的感觉到她在微笑，但是当你仔细看她时，她的笑容仿佛又有了另一层的含义。根据研究人员微表情分析，在蒙娜丽莎的微笑中，蕴含着高兴、厌恶、恐惧、甚至是愤怒的意味，使得这位欧洲贵妇的微笑更加的神秘。
而近年来，更是有专家发现，如果将这幅《蒙娜丽莎》倒过来，将看到令人恐惧的事物。早在2015年的时候，在美国就有一位收藏家，将复制版《蒙娜丽莎》旋转一百八十度之后，观察到了令人惊讶的现象。原来画中的背景，从山峦河流，变成了狮子、猿猴以及水牛，而更恐怖的是，在画中人的左侧，仿佛还看到了一直与鳄鱼和蛇十分相像的动物，不禁让人感到害怕。若把这幅画倒过来看，可能就不会觉得她一直在微笑了。
不仅如此，在这幅画像中，还隐藏着许多尚未揭开的谜团。比如在蒙娜丽莎眼睛中所隐藏的数字和字母，让人不得不好奇，达·芬奇到底想要传递给后人们怎样的信息呢？所有的这些，都有待日后的研究来说明。